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Atividade

90075 - Técnicas de aperfeiçoamento em avaliação da atividade antioxidante e fototoxicidade de ingredientes cosméticos

Período da turma:

15/07/2019 a 29/01/2020

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Descrição:

PROGRAMA
O objetivo desse programa é avaliar a atividade antioxidante e fototoxicidade de ingredientes cosméticos, por meio da utilização da sonda DCFH-DA em cultura de células em monocamadas e por meio do ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU PT, de acordo com OECD 432.
Serão avaliados diferentes compostos antioxidantes e com potencial fotoprotetor de origem natural e sintética.
A sonda 2,7-diclorodihidrofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) é frequentemente utilizada na avaliação da geração de EROs intracelular, tais como radical hidroxil, peróxido de hidrogênio e ânion carbonato. O DCFH-DA pode sofrer reações de hidrólise pelas esterases celulares formando o composto DCFH, que por sua vez, pode ser convertido pelas EROs no composto 2,7- diclorodihidrofluoresceína (DCF), o qual pode ser medido por fluorescência (KALYANARAMAN et al., 2012; ALVES et al., 2016). Uma vez que o ensaio utilizando a sonda DCFH-DA avalia as EROs formadas em cultura celular e permite a exposição das células à radiação UV, este proporciona resultados biologicamente mais relevantes em relação a outros ensaios, os quais consistem na utilização de radicais livres sintéticos, tais como DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) e ABTS (2,2-azinobis-[3-etil-benzotiazolin-6-ácido sulfônico) presentes em um meio de reação aquoso/alcoólico.
Para a realização do ensaio com DCFH-DA, células HaCaT (queratinócitos humanos imortalizados) serão plaqueadas em placa de 96 poços e incubadas por 24h. Em seguida, os poços foram lavados com tampão PBS, as substâncias em estudo serão adicionadas e as placas foram incubadas por 1h. Após esse período, a sonda DCFH-DA (10 µM) será adicionada aos poços, seguido de incubação por 30 minutos. A seguir, as placas serão lavadas com tampão PBS e expostas ou não a uma dose de radiação UVA (Simulador solar Dr. Hönle tipo SOL- 500 (Planegg, Alemanha) de 4 J/cm2 e, em seguida, submetidas a análise em leitor de microplacas acoplado a leitor de fluorescência nos comprimentos de onda de 485 nm (excitação) e 528 nm (emissão) (ALVES et al., 2016).
Os resultados foram expressos em % de fluorescência em relação ao controle não tratado (+UV), considerado 100%. Foram utilizados como controles a norfloxacina (100 µg/ml) e quercetina (10 µg/ml). Os estudos foram realizados em triplicata.
O teste de fototoxicidade será realizado em cultura de fibroblastos por determinação da viabilidade celular, por meio da determinação da captação do corante vital vermelho neutro, conforme protocolo INVITTOX nº 78 (LIEBSCH; SPIELMANN, 1998).
Após a avaliação da sensibilidade dos fibroblastos à radiação UVA, serão utilizadas 2 microplacas de 96 poços para cada série de diferentes concentrações de cada extrato / substância isolada em estudo, uma para a determinação da citotoxicidade e a outra para a determinação da fototoxicidade. Para tal, após a incubação de uma suspensão dos fibroblastos no meio de cultura, serão adicionadas em sextuplicata, 8 diferentes concentrações de cada extrato / substância em estudo. Após período de incubação, uma das microplacas será submetida à radiação UVA por 50 minutos e outra mantida em uma caixa escura (controle para a determinação da citotoxicidade). Após período de incubação será adicionada uma solução do corante vital vermelho neutro e após a extração do corante das células, será calculada a viabilidade celular relativa, ou seja, a viabilidade das microplacas, submetidas e não submetidas à radiação UVA. Os dados serão analisados por meio do Software Phototox para o cálculo do PIF (photo irritation factor - fator de fotoirritação) - e do MPE (mean photo effect – foto efeito médio), para posterior previsão do potencial fototóxico. Uma substância que apresenta PIF entre 2 e 5 ou MPE entre 0,1 e 0,15 pode ser classificada como “provavelmente fototóxica”.

BIBLIOGRAFIA
ALVES, G.A.D.; SOUZA, R.O.; ROGEZ, H.; MASAKI, H.; FONSECA, M.J. Cecropia obtusa, an Amazonian ethanolic extract, exhibits photochemoprotective effect in vitro and balances the redox cellular state in response to UV radiation. Industrial Crops and Products, v. 94, p.893-902, 2016
CAMBON, M.; ISSACHAR, N.; CASTELLI, D.; ROBERT, C. An in vivo method to assess the photostability of UV filters in a sunscreen. J. Cosmet. Sci., v.52, p.1–11, 2001.
De OLIVEIRA, A. L. L. Avaliação química e biológica de espécimens de Bostrychia radicans (Rhodomelaceae). 2009. 88f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – FCFRP, USP, Ribeirão Preto, 2009.
DUNLAP, W.C.; CHALKER, B.E.; BANDARANAYAKE, W.M.; WU WON, J.J. Nature's sunscreen from the Great Barrier Reef, Australia. Int J Cosmet Sci., v.20, p.41-51, 1998.
GASPAR, L.R.; MAIA CAMPOS, P.M.B.G. Evaluation of the photostability of different UV filters associations in a sunscreen. Int J Pharm, v. 307, n. 2, p. 123-128, 2006.
KALYANARAMAN, B.; DARLEY-USMAR, V.; DAVIES, K.J.A.; DENNERY, P.A.; FORMAN H.J.; GRISHAM, M.B.; MANN, G.E.; MOORE, K.; ROBERTS, J.; ISCHIROPOULOS, H. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med, v.52, 2012.
LIEBSCH, M.; SPIELMANN, H. INVITTOX Protocol No. 78: 3T3 NRU Phototoxicity Assay. European Commission DG-JRC, ECVAM, SIS Database, 1998. Last update October 2002. .
Pallela, R.; Na-Young, Y.; Kim, S.K. Anti-photoaging and photoprotective compounds derived from marine organisms. Mar Drugs. v.8, n.4, p.1189-1202, 2010.
PARIS, C.; LHIAUBET-VALLET, V.; JIMÉNEZ, O.; TRULLAS, C.; MIRANDA, M.A. A Blocked Diketo Form of Avobenzone: Photostability, Photosensitizing Properties and Triplet Quenching by a Triazine-derived UVB-filter. Photochem Photobiol, 2008. DOI: 10.1111/j.1751-1097.2008.00414.x
TORRES, A.; HOCHBERG, M.; PERGAMENT, I.; SMOUM, R.; NIDDAM, V.; DEMBITSKY, V.M.; TEMINA, M.; DOR, I.; LEV, O.; SREBNIK, M.; ENK, C.D. A new UV-B absorbing mycosporine with photo protective activity from the lichenized ascomycete Collema cristatum. Eur. J Biochem, v.271, p.780–784, 2004.

Carga Horária:

567 horas

Tipo:

Obrigatória

Vagas oferecidas:

Ministrantes:

Lorena Rigo Gaspar Cordeiro

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