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Atividade

127188 - Caracterização fenotípica e molecular de linhagens de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli de origens diversas“

Período da turma:

09/09/2024 a 11/10/2024

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Descrição:

INTRODUÇÃO
O gênero Campylobacter pertence à família Campylobacteraceae e atualmente é composto por 32 espécies (Fitzgerald, 2015; Piccirillo et al. 2016; Gilbert et al. 2017; Costa; Iraola, 2019). São bactérias Gram-negativas de morfologia diversificada, apresentando-se, usualmente, na forma espiral ou curva (Ketley, 1997; Fitzgerald, 2015; Umaraw et al., 2017). As duas espécies de maior ocorrência e importância clínica são C. coli e C. jejuni, causadoras de doenças gastrointestinais em humanos (Man, 2011; Fitzgerald, 2015; EFSA, 2021). O isolamento de Campylobacter como causa de gastroenterites em humanos nos países da Europa e na América do Norte é muito frequente (EFSA, 2021; CDC, 2024). Porém, o isolamento e o estudo de Campylobacter não são muito frequentes no Brasil, o que dificulta avaliar a dimensão dessas espécies como causadoras de doença em humanos e animais, bem como, determinar o impacto de sua presença em alimentos e no meio-ambiente (Gomes et al., 2018; Silva et al., 2018; Würfel et al., 2019). Além disso, há relativamente poucos trabalhos que utilizaram métodos fenotípicos e moleculares para caracterizar linhagens de C. jejuni e de C. coli isoladas no país (Aquino et al., 2010; Da Silva Quetz, et al., 2010; Vaz et al., 2014; Gomes et al., 2016; Silva et al., 2016; Gomes et al., 2018; Silva et al., 2018; Würfel et al., 2019).

OBJETIVOS
Os objetivos desse Programa de Atualização são proporcionar aos participantes a prática e o conhecimento teórico de algumas metodologias utilizadas para avaliar a diversidade genética, o potencial patogênico e a suscetibilidade a antimicrobianos de linhagens de C. jejuni e C. coli isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente no Brasil

MATERIAL E MÉTODOS
1- Amostras Bacterianas
Serão estudadas 15 linhagens de C. jejuni e 15 linhagens de C. coli isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente, no Brasil.
As linhagens que se encontram criopreservadas em freezer -80ºC serão cultivadas em meio BBLTM Agar Base Columbia (BD) suplementado com 0,4% (m/v) de carvão ativado (Neon) e 5% (m/v) de solução redutora de oxigênio FBP (0,05% de sulfato ferroso (Labsynth), 0,05% de piruvato de sódio (Vetec) e 0,05% de metabisulfito de sódio (Lasynth) diluído em água estéril. Após a semeadura, as culturas serão incubadas por 24 horas, a 42°C em jarra sob condições de microaerofilia, que será obtida através da técnica de passivação do cobre descrita por Filgueiras e Hofer (1989), com modificações. Para uma jarra de 3,5 L será utilizada 1 pastilha de carbonato de cálcio (Sonrisal®) triturada, 10g de esponja de aço (Bombril®) embebida em 100 mL de solução acidulada de cobre [(Sulfato de cobre II P.A (Vetec), Ácido sulfúrico P. A. (Pro- Analysis) e Tween 80 (Merck) diluído em água destilada)]. A mistura será colocada em um recipiente e inserida na jarra imediatamente, e essa vedada para que os níveis gasosos atinjam as proporções desejáveis.

2. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos
Será realizado para todas as 15 linhagens de C. jejuni e as 15 linhagens de C. coli a serem estudadas. A concentração inibitória mínima (CIM) será detectada por Etest, seguindo as especificações do documento M45-A2 de 2010 da CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A partir de um crescimento em ágar sangue a 42°C por 24 horas em atmosfera de microaerofilia, será feita uma suspensão em salina 0,8% de cada linhagem até a escala 0,5 de McFarland. Com o auxílio de um swab estéril, a suspensão será semeada em ágar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e as fitas de Etest dos antimicrobianos serão colocadas sobre as placas, que serão incubadas a 37°C por 48 horas em atmosfera de microaerofilia. Após a incubação será determinada a CIM dos seguintes antimicrobianos: eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina e doxaciclina.

3. Extração e verificação da pureza do DNA genômico
O DNA genômico de todas as 15 linhagens de C. jejuni e as 15 linhagens de C. coli será extraído conforme descrito por Campioni et al. (2014), com modificações. A integridade do DNA extraído será avaliada em eletroforese horizontal em gel de agarose 0,8% preparado com TAE (Tris Acetato EDTA) 1X. Os géis serão corados por 20 minutos com solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL), e observados em transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrados em software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad). A concentração e pureza do DNA genômico extraído serão determinadas conforme Sambrook e Russell (2001). O DNA genômico extraído será utilizado na pesquisa dos genes marcadores de virulência por PCR e tipagem molecular por MLST.

4. Pesquisa dos genes marcadores de virulência por PCR
Os DNAs genômicos das linhagens utilizados na pesquisa dos genes marcadores de virulência por PCR serão extraídos e quantificados como descrito no item 3.3. A PCR para pesquisa dos genes marcadores de virulência será realizada para todas as 15 linhagens de C. jejuni e as 15 linhagens de C. coli a serem estudadas. Os genes pesquisados serão flaA, conforme descrito por Wassenaar et al. (2000); cdtB, cdtC, ciaB e virB11, conforme descrito por Datta et al. (2003); cadF conforme descrito por Konkel et al. (1999); iam, docA, flhA, conforme descrito por Müller et al. (2005); cdtA conforme descrito Hickey et al. (2000); e wlaN conforme descrito por Linton et al. (2000). As reações de PCR seguirão as condições descritas por Wieczorek e Osek (2008).
Os produtos amplificados serão visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Após a eletroforese, o gel será corado por 30 minutos em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL), observado em transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrado em software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).

5. Multilocus sequence typing (MLST)
Um total de 10 linhagens, sendo 5 C. jejuni e 5 C. coli serão tipadas por MLST. O DNA genômico das linhagens de C. jejuni será extraído como descrito no item 3.3.
A técnica de MLST será realizada utilizando sete genes housekeeping (aspA, glnA, gltA, glyA, pgm, tkt e uncA). Os primers utilizados na amplificação dos genes housekeeping, bem como a temperatura de hibridação dos mesmos serão conforme o disposto no banco de dados de MLST para C. jejuni (http://pubmlst.org/campylobacter/info/primers.shtml).
As reações de amplificação serão realizadas em volume final de 50µl, como descrito por Dingle et al. (2001). Os produtos de amplificação serão submetidos a eletroforese em gel de agarose, corados durante 30 minutos com brometo de etídeo (0,5 µg/mL), observados em transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrados com o software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).
Os amplicons obtidos de cada um dos sete genes housekeeping serão purificados utilizando o Kit de purificação Pure LinkTM Quick PCR Purification Kit (Invitrogen - Life Technologies), para posteriormente, serem sequenciados. Para cada gene serão realizadas pelo menos quatro reações de amplificação, duas em sentido forward e duas em sentido reverse, para garantir a reprodutibilidade e qualidade das sequências obtidas.
O sequenciamento será realizado no Laboratório de Genética Molecular, localizado na Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, em sequenciador automático de DNA ABI 3500xL (Applied Biosystems - Life Technologies).

5.1. Análise dos dados de MLST (genes housekeeping) e construção do diagrama e dendrograma de similaridade genética
Cada conjunto de sequências de um mesmo gene e de uma mesma linhagem será analisado individualmente, pelo programa ChromasPro versão 1.41 (Technelysium PtY LTD). Pela análise dos eletroferogramas serão gerados contigs, ou seja, sequências sobrepostas do gene em questão, a fim de obter-se a sequência consenso para cada gene de cada linhagem sequenciada. Serão utilizadas sequências padrões dos genes housekeeping, disponíveis no banco de dados de C. jejuni.
O programa eBURST V3 (http://eburst.mlst.net/) será utilizado para a construção do diagrama de similaridade genética das linhagens deste estudo e das linhagens disponíveis no banco de dados com o intuito de demonstrar as relações filogenéticas entre as mesmas.
Também será construído um dendrograma de similaridade genética de MLST a partir das sequências obtidas dos sete genes housekeeping das linhagens estudadas nesta metodologia. As sequências referentes aos genes housekeeping serão concatenadas, simulando uma sequência única, na seguinte ordem: aspA, glnA, gltA, glyA, pgm, tkt e uncA. A partir do alinhamento destas sequências concatenadas, o dendrograma será construído utilizando-se o método UPGMA, baseado no critério de máxima parcimônia com o modelo de correção de distância de dois parâmetros de Kimura, no programa BioNumerics 7.1 (AppliedMaths, Keistraat, Belgium).

CRONOGRAMA DE EXECUCÃO DAS ATIVIDADES
1- Reativação das linhagens bacterianas;
2- Preparo de reagentes e meios de cultura para a execução das metodologias;
3- Teste de susceptibilidade a antimicrobianos
4- Pesquisa de genes de virulência por PCR;
5- Multilocus sequence typing (MLST);
6- Revisão da literatura referente a cada uma das metodologias que serão realizadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Dingle, K.E., F.M. Colles, D.R. Wareing, R. Ure, A.J. Fox, F.E. Bolton, H.J. Bootsma, R.J. Willems, R. Urmin, and M.C. Maiden. 2001. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J. Clin. Microbiol. 39:14–23.

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Vaz, C. S.; Voss-Rech, D.; Pozza, J. S. et al. Isolation of Campylobacter from Brazilian broiler flocks using different culturing procedures. Poult Sci, v. 93 (11), p. 2887-2892, 2014.

Wassenaar, T.M., Bleumink-Pluym, N.M.C., Van der Zeijst, B.A.M., 1993. Inactivation of Campylobacter jejuni flagellin genes by homologous recombination demonstrates that flaA but not flaB is required for invasion. EMBO J. 10, 2055e2061

Würfel, S. F. R.; Silva, W. P.; Oliveira, M. G.et al. Genetic diversity of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from poultry meat products sold on the retail market in Southern Brazil, Poult Sci, v. 98 (2), p. 932–939, 2019.

Carga Horária:

100 horas

Tipo:

Obrigatória

Vagas oferecidas:

Ministrantes:

Juliana Pfrimer Falcão

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