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Atividade

114459 - Teoria e Prática de Técnicas Utilizadas nos Estudos Epidemiológicos de Bactérias.

Período da turma:

12/09/2023 a 07/12/2023

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Descrição:

INTRODUÇÃO
A epidemiologia bacteriana, alguns anos atrás, era estudada praticamente levando-se em conta características fenotípicas clássicas tais como biotipo, sorotipo, fagotipo, padrão de suscetibilidade a antimicrobianos, entre outros. Essas técnicas de tipagem acima citadas são muito úteis e fornecem importantes informações e por essa razão são ainda muito utilizadas. Entretanto, esses métodos convencionais são muitas vezes limitados por sua baixa capacidade de diferenciação de subtipos dentro de uma determinada espécie e problemas referentes a reprodutibilidade (Olive e Bean, 1999).
Atualmente, muitos métodos genotípicos são utilizados na identificação, caracterização e em estudos epidemiológicos e taxonômicos bacterianos com grande sucesso. Tais estudos de investigação epidemiológica molecular possibilitam determinar a fonte e os veículos de transmissão, bem como, informam se os microrganismos envolvidos nos surtos representam ou não um único clone. A premissa básica de todos esses métodos reside no fato que amostras bacterianas relacionadas epidemiologicamente apresentam um precursor comum (Olive e Bean, 1999; Van Belkum et al., 2001).
Métodos moleculares são utilizados tanto na tipagem como em estudos epidemiológicos de bactérias de interesse clínico. Dentre as bactérias de interesse clínico nosso laboratório tem especial interesse em estudar bactérias do gênero Salmonella. Campylobacter, Shigella e Yersinia. Para a tipagem molecular e estudos epidemiológicos de Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp., Yersinia spp., as metodologias de ERIC-PCR, Pulsed-field gel electrophoresis, sequenciamento de genes, sequenciamento do genoma completo, entre outras, vêm sendo utilizadas com sucesso (Fredriksson-Ahomaa et al. 1999; Wojciech et al. 2004; Falcão et al. 2006; Romani et al., 2007; Rivoal et al. 2008; Souza et al. 2010; Campioni et al. 2012; Campioni & Falcao 2014; Almeida et al. 2013; Almeida et al. 2015; Gomes et al., 2016; Frazão et al; 2017; Vilela et al., 2019, Gonzales et al., 2020; Seribelli el al 2020; Vilela et al., 2022)

OBJETIVOS

Os objetivos desse Programa de Atualização são proporcionar ao candidato(a) a prática e o conhecimento teórico de algumas das técnicas utilizadas nos estudos epidemiológicos de bactérias de interesse clínico.

MATERIAL E MÉTODOS

1- Amostras Bacterianas
Nesse Programa de Atualização trabalharemos com bactérias de interesse clínico a serem escolhidas entre os gêneros Salmonella, Campylobacter, Yersinia e Shigella. As amostras bacterianas fazem parte da coleção do nosso laboratório na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP.

2- Pesquisa dos genes de virulência por PCR
O DNA genômico será extraído segundo descrito por Campioni & Falcao (2014) e suas concentrações determinadas segundo Sambrook e Russel (2001). De maneira geral, o procedimento para PCR será feito de acordo com a metodologia de Saiki et al.(1998). Os primers e os parâmetros (Desnaturação, Pareamento, Extensão) para os ciclos de amplificação serão padronizados, seguindo-se como padrão inicial as condições especificadas para o gene inv como descrito por Rasmussen et al. (1994), para o gene ail segundo Nakajima et al. (1992), do gene ystA como descrito por Ibrahim et al. (1997), do gene ystB segundo Ramamurthy et al. (1997) e do gene virF como descrito por Wren e Tabaqchali (1990), genes de virulência de Y. enterocolitica. Os produtos de amplificação de PCR serão submetidos a eletroforese em gel de agarose, corados com brometo de etídeo (0.5 μg/mL), visualizados por luz U.V. e registrados com o software fotográfico. Alternativamente, poderão ser estudados os genes de virulência de Salmonella, Campylobacter ou Shigella.

3- Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
As amostras serão cultivadas em BHI a 25oC sob agitação por 12-18hs e reinoculadas em LB até atingirem D.O. entre 0.6 e 0.9. O DNA genômico será preparado em blocos de gel de agarose segundo protocolo de Falcão et al. (2006). Esse preparo envolve a inclusão das células bacterianas em blocos de gel de agarose. O DNA preparado dessa forma será digerido com XbaI por 12-16 horas e os fragmentos serão resolvidos por PFGE. As condições da corrida serão realizadas segundo segundo instruções dos manuais disponíveis no Pulse Net USA (Pulsenet 2004) para Salmonella spp (Ribot et al. ,2006) e Campylobacter spp. (Ribot et al., 2001) . Após a corrida, os géis serão corados com brometo de etídeo (0.5 μg/mL), visualizados por luz U.V. e registrados com o software fotográfico.
A análise dos dados será feita conforme descrito por Souza et al. (2010) e/ou Campioni et al. (2012), utilizando-se o programa Bionumerics 7.0 (AppliedMaths, Keistraat, Belgium).

4- Multilocus Sequence Typing
Será realizado para linhagens de Salmonella spp. Os primers para amplificação dos sete genes housekeeping (aroC, dnaN, hemD, hisD, purE, sucA e thrA) e a temperatura de hibridação encontram-se disponibilizados no banco de dados de Salmonella (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica).
As reações de amplificação serão realizadas em volume final de 50 µl, como descrito por Souza et al. (2010). Os produtos de amplificação serão submetidos à eletroforese em gel de agarose corados com brometo de etídeo (0,5 µg/mL), observados em transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrado em software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad). Os amplicons serão purificados e posteriormente serão sequenciados.
Para análise dos dados será utilizado o programa ChromasPro versão 1.41 (Technelysium PtY LTD). A construção do diagrama de similaridade genética será realizada com a utilização do programa eBURSTv3 (http://eburst.mlst.net/).

CRONOGRAMA DE EXECUCÃO DAS ATIVIDADES
1-Lavagem e esterelização de vidrarias;
2-Preparo de reagentes e meios de cultura para a execução das metodologias;
3-Pesquisa de genes de virulência por PCR;
4-Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE);
5-Multilocus sequence typing (MLST);
6-Revisão da literatura referente a cada uma das metodologias que serão realizadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Gonzales, J.C.; Seribelli, AA.; Gomes, C.N.; Rodrigues, D.P.; Campioni, F.; Passaglia, J.; Silva, P.; Falcao, J.P. A high number of multidrug-resistant and predominant genetically related cluster of Shigella flexneri strains isolated over 34 years in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v.1, p.1563-1571, 2020.

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Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.; Erlich, H.A. Primer-directed enzimatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, v. 239, p. 487-491, 1988.

Sambrook, J., Russuel, W. D., Molecular Cloning: a laboratory manual. 3th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Seribelli, A.A.; Cruz, M.F.; Frazao, M.R.; Almeida, F; Vilela, F.P.; Medeiros, M.I.C.; Rodrigues, D.P.; Allard, M.W.; Falcao, J.P. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Typhimurium isolates from humans and foods in Brazil. PLoS One, v.15, p.e0237886, 2020.

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Vilela, F. P. ; Rodrigues, D. P. ; Costa, R. G. ; Tiba-Casas, M. R. ; Falcao, J. P. ; Campioni, F. . High similarity and high frequency of virulence genes among Salmonella Dublin strains isolated over a 33-year period in Brazil. Braz. J. Microbiol. (online), v. X, p. 1-13, 2019.
Wojciech, L., Staroniewicz Z., Jakubczak A., Ugorski M. Typing of Yersinia enterocolitica isolates by ITS profiling, REP- and ERIC-PCR. J. Vet. Med. 51 238-244, 2004.

Wren, B.W.; Tabaqchali, S. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by the polymerase chain reaction. Lancet, v.336, p. 693, 1990.

Carga Horária:

96 horas

Tipo:

Obrigatória

Vagas oferecidas:

Ministrantes:

Juliana Pfrimer Falcão

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